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頂空氣相色譜系列講座（18）
人體血液中一氧化碳的分析——分光光度法定量5
三、分光光度法
1、紫外光譜法原理
CO中毒血中可能含有三種血紅蛋白： ⑴碳氧血紅蛋白（HbCO）——與CO結(jié)合的Hb； ⑵ 氧合血紅蛋白——與O2結(jié)合的Hb ⑶血紅蛋白——沒(méi)結(jié)合的Hb。 它們?cè)?00nm~600nm范圍內(nèi)吸收光譜見(jiàn)圖-2。碳氧血紅蛋白zui大吸收峰分別在568.2nm和538nm；氧合血紅蛋白zui大吸收峰分別在576.2nm和542nm；血紅蛋白zui大吸收峰在555nm。如血液含三種形式的血紅蛋白（其中的微量高鐵血紅蛋白可忽略不計(jì)），則其光譜呈現(xiàn)三種光譜的混合形。如在血液中加入還原劑（連二亞硫酸鈉或硫化銨）溶液，則可將氧合血紅蛋白及高鐵血紅蛋白還原為血紅蛋白，而碳氧血紅蛋白不被還原，因而血液中只存在碳氧血紅蛋白和血紅蛋白兩種不同的形式，它們的吸收光譜見(jiàn)圖-1
用分光光度法測(cè)定血中HbCO定性和定量是基于HbCO和對(duì)光譜的特征吸收不同，和特征吸收與濃度有量的關(guān)系。HbO2在589nm~577nm和556nm~536nm區(qū)間有兩條吸收譜帶，其zui大吸收是579nm和542nm。HbCO在579nm~564nm和548nm~530nm區(qū)間有兩條吸收譜帶，其中zui大吸收是572nm和539nm。加入還原劑后檢血中HbO2和高鐵血紅蛋白被還原為血紅蛋白（Hb），此時(shí)吸收譜帶變?yōu)橐粭l，即在530nm~580nm之間，zui大吸收為556nm。而HbCOzui大吸收波長(zhǎng)仍是572nm和539nm不變。
2、具體操作步驟
取CO中毒心血（檢材血）0.1ml~0.3ml，加10ml 0.1%硫化銨或多硫化銨水溶液（內(nèi)含連二亞硫酸鈉2.5mg/ml）稀釋混勻，測(cè)定500nm~600nm之間的吸收?qǐng)D譜，用切線(xiàn)法量取555nm和540nm處的吸收值見(jiàn)圖-2，計(jì)算血中HbCO% = F ×（A540/B555）×100公式，式中F為常數(shù)1.5；A540見(jiàn)圖-2中a~b（cm）線(xiàn)段長(zhǎng)；B555見(jiàn)圖-2中c~d（cm）線(xiàn)段長(zhǎng)。此法適合檢材血中含量HbCO% > 40% 時(shí)效果好，此方法在辦案中使用較多。
3、另一種經(jīng)驗(yàn)方法
適合各種CO濃度檢材血的HbCO%測(cè)定，用0.4%氨水溶液稀釋的含CO血在529nm和582nm處有吸收峰，稀釋液做參比。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式：HbCO% = （A529－A582）×185/（A529－0.07）進(jìn)行計(jì)算。185和0.07均為經(jīng)驗(yàn)常數(shù)，本方法要求稀釋檢材血的吸光度值在0.4~0.6范圍準(zhǔn)確度高。
